Последовательность митохондриального генома тасманского тигра (Thylacinus cynocephalus)

1. Аннотация Мы сообщаем о первых двух полных митохондриальных геномных последовательностях тилацина...
2. Таблица 1.
3. Свойства образцов тилацина
4. Филогения тилацина
5. Сравнение с опубликованными последовательностями
6. метагеномика
7. Перспективы полного генома тилацина
8. Выводы
9. методы
10. Пробоподготовка и секвенирование
11. Сборка последовательностей митохондрий тилацина и нумбата
12. Филогенетический анализ митохондриального генома
13. Оценка доли ядерной ДНК тилацина

Аннотация

Мы сообщаем о первых двух полных митохондриальных геномных последовательностях тилацина ( Thylacinus cynocephalus ) или так называемого тасманийского тигра, вымершего с 1936 года. Филогенетическое положение тилацина в австралидельфианском сумчатом веществе уже давно обсуждается, и здесь мы обеспечиваем сильную поддержку базального тилацина. положение в Dasyuromorphia, которому помогает последовательность митохондриального генома, которую мы произвели из существующего numbat ( Myrmecobius flaviatus). Удивительно, но обе наши последовательности тилацина отличаются на 11–15% от предполагаемых митохондриальных генов тилацина в GenBank, причем один из наших образцов был получен от прямого потомка ранее секвенированного индивида. Наши данные отбирают каждый митохондриальный нуклеотид в среднем в 50 раз, обеспечивая тем самым первую высокоточную эталонную последовательность для генетики популяции тилацина. Наши две последовательности отличаются только пятью нуклеотидами из 15 452, что указывает на очень низкое генетическое разнообразие незадолго до исчезновения. Несмотря на сильное загрязнение образцов бактериальной и человеческой ДНК и их умеренную историю хранения, мы оцениваем, что до трети всей ДНК в каждом образце происходит от тилацина. Содержание микробов в двух образцах тилацина было подвергнуто метагеномному анализу и продемонстрировало разительные различия между пойманным в дикой природе человеком и рожденным в неволе. Таким образом, это исследование добавляет все больше доказательств того, что обширное секвенирование музейных коллекций возможно и желательно, и может дать полные геномы.

Тилацин привлек значительное внимание биологов по нескольким причинам. Морфологически уникальный и филогенетически изолированный в своем собственном таксономическом семействе (Thylacinidae), он также предоставляет один из наиболее ярких примеров конвергентной эволюции у млекопитающих, демонстрируя удивительное эко-морфологическое сходство с представителями семейства плацентарных хищных Canidae (то есть волками и собаками). , Причины и сроки его исчезновения как в его историческом ареале (срединные леса и прибрежные пустоши в Тасмании), так и в его голоценовом распространении (в континентальной Австралии и Новой Гвинее) представляют большой интерес для многих исследователей ( Джонсон и Вроу 2003 ). Он стал центром дискуссий о вымирании крупных млекопитающих, которые включают размышления о том, можно ли воскресить виды путем сочетания древних исследований ДНК и современной репродуктивной медицины ( Весло 2000 ). Пока совсем недавно ( Pask et al. 2008 ), извлечения из музейных образцов не дали пригодных количеств эндогенной ДНК, а скорее бактериальных или человеческих загрязнений (см. Дополнительный материал), несмотря на наличие сотен образцов тилацина в государственных и частных коллекциях. Поскольку доступная тилациновая ДНК деградирует и в небольшом количестве, большинство филогенетических исследований было сосредоточено на коротких сегментах широко используемых митохондриальных генов, например, 12S рРНК и цитохрома b ( cytb ) ( Томас и соавт. 1989 ; Краевский и соавт. 1992 , 1997 , 2000 ).

В нескольких исследованиях изучены филогенетические связи тилацина. Некоторые ранние морфологические исследования связывали его с сумчатым в Южной Америке (например, Синклер 1906 ). Более поздние морфологические филогении поместили его в австралийскую сумчатую радиацию в Dasyuromorphia, кладе, также включающей numbat ( Myrmecobiusasciatus ) и семью Dasyuridae (насекомоядные и плотоядные сумчатые) (например, Сарич и соавт. 1982 ). Первоначальное молекулярное исследование использовало фрагмент размером 219 п.н. из гена рибосомальной РНК 12S и поместило тилацин в Dasyuridae ( Томас и соавт. 1989 ), в соответствии с более ранним серологическим исследованием ( Сарич и соавт. 1982 ). Более обширный анализ с использованием генов 12S и cytb и ядерного белка протамина P1 позволил предположить родственные отношения Thylacinidae + Dasyuridae с базальным положением для нумбата, хотя эта топология не имела сильной статистической поддержки ( Краевский и соавт. 1992 , 1997 , 2000 ).

В этом исследовании мы использовали технологию секвенирования «следующего поколения» и усовершенствованные методы выделения древней ДНК для получения двух высокоточных геномов митохондрий тилацина. Новые данные позволяют более точно определить филогенетическое положение тилацина среди сумчатых. В целом, успех данного проекта показывает, что музейные экспонаты, сохраненные в различных условиях, поддаются геномному секвенированию.

Результаты и обсуждение

Секвенирование митохондриальных геномов тилацина и нумбата

Четыре образца тилацина были отобраны, три хранились в виде высушенных шкур, а другой - почти полное животное, помещенное в этанол. Из каждого образца мы пытались извлечь ДНК из стержней волос ( Гилберт и соавт. 2007a ). Один из сухих образцов и образец, хранящийся в этаноле, дали достаточно ДНК, чтобы попытаться провести геномный анализ. Успешно обработанная сухая кожа была от человека, который умер в Национальном зоопарке в Вашингтоне в 1905 году и с тех пор хранился при комнатной температуре. Этот человек является прямым потомком женского экземпляра, секвенированного Краевский и соавт. (1997 , 2000 ), а история животного хорошо документирована (см. Дополнительный материал). Экстракт, сохраненный в этаноле, умер в лондонском зоопарке в 1893 году и был приобретен Стокгольмским университетом (в то время «Zootomiska Institutet»). Он был переведен в Шведский музей естественной истории (NRM) в Стокгольме, вероятно, в начале 1970-х годов и с тех пор хранится там. Это распотрошенный образец, предположительно женский.

Из сухого образца () и сохраненного в этаноле образца () мы сгенерировали 104 956 и 1 037 369 считываний соответственно, используя наш секвенсор Roche GS FLX (454 Life Sciences). Средняя длина чтения составила всего 87,5 и 67,0 п.н. соответственно, что намного ниже, чем в большинстве современных образцов. Основной причиной является поврежденное состояние ДНК, которое включает высокую степень разрушения двухцепочечных. (Однако обратите внимание на то, что длина считывания у современных волос может быть намного короче, чем у других тканей, возможно, из-за повреждения во время кератинизации процесса образования волос [ Линч и соавт. 2001 ], хотя различия в протоколах подготовки образцов между двумя образцами нумбата также являются фактором.) Из общего метагенома мы извлекли чтения, которые соответствовали имеющемуся северному кволлу ( Dasyurus hallucatus ), митохондриальному геному или контигам, созданным из таких чтений. и собрал их в независимые согласованные митохондриальные геномы с 66,8- и 49,7-кратным средним охватом (т. е. глубиной считывания) для двух образцов тилацина. Мы обрезали концы этих сборок, чтобы удалить области, которые включали длинные, почти идентичные повторы, которые нельзя уверенно секвенировать с помощью технологий краткого чтения, оставляя непрерывные интервалы каждого из 15 492 оснований, которые содержат все известные митохондриальные гены и тРНК. В дюжине позиций GS FLX не смог определить точную длину гомополимерного прогона, что является хорошо известным ограничением этой технологии. Мы решили все из них, кроме четырех, используя последовательности ПЦР и Сэнгера, и аннотировали оставшиеся интервалы, чтобы указать, что, например, цикл состоит из 6 или 7 Ts. За исключением этих неопределенностей, существует только 5 нуклеотидных (nt) различий (замен) между последовательностями из двух образцов тилацина.

Таблица 1.

Некоторые свойства секвенированных образцов тилацина и нумбата

Спинные и вентральные изображения кожи USNM 125345, молодого взрослого мужчины, который умер в 1905 году в Национальном зоопарке; Образец тилацина 1 секвенирован в нашем исследовании (любезно предоставлено Национальным музеем естественной истории фотографических услуг).

Образец тилацина 2 был секвенирован в нашем исследовании из коллекции млекопитающих Шведского музея естественной истории (Стокгольм), NRM 566599, который умер в 1893 году в Лондонском зоопарке. (Фото: Staffan Waerndt, © Шведский музей естественной истории.)

Чтобы помочь определить филогенетическое положение тилацина в пределах Dasyuromorphia, мы также секвенировали митохондриальный геном нумбата, используя тот же подход. Два образца были секвенированы, один из печени и один из стержней волоса, которые мы собрали в последовательности митохондриального генома с 41,2- и 206,5-кратным средним охватом, соответственно.

Свойства образцов тилацина

Мы выявили значительное количество загрязнения ДНК человека в образцах тилацина, в отличие от нашего более раннего анализа шерстистых костей мамонта ( Пойнар и соавт. 2006 ; Гилберт и соавт. 2007b ) и стержни волос ( Гилберт и соавт. 2007a , 2008 ; Миллер и соавт. 2008 ). Например, из образца, сохраненного в этаноле (тилацин 2 в), мы идентифицировали 44 493 считывания (4,3%), которые произошли из ядерного генома человека, и 136 считываний из митохондриального генома человека. Распределение длины считывания для человеческой ДНК аналогично распределению для тилациновой ДНК (дополнительный рис. S3), что позволяет предположить, что загрязнение было введено давно. Отношение ядерных чтений к митохондриальным чтениям (327: 1) предполагает, что загрязнение происходит от ткани человека или тканей, не особенно богатых митохондриальной ДНК. (Сравните с отношениями nu / MT в.) Для тилацина 1 (сухая кожа) 8,9% считываний были человеческими, а их средняя длина составила 131,9 п.н., что указывает на более недавнее происхождение. Мы предполагаем, что высокий уровень загрязнения как в образцах тилацина, так и сложность удаления последовательностей загрязнений с использованием традиционных подходов «отбеливания» обусловлены историей отверждения образцов (см. Дополнительный материал).

Чтобы оценить долю наших считываний, которые состоят из ядерной ДНК тилацина, мы выполнили эксперимент, разработанный, чтобы справиться с отсутствием полной последовательности генома у филогенетически близкого родственника и с ограниченными длинами секвенированных фрагментов тилацина. Мы извлекли аннотированные области, кодирующие белок, из опубликованного генома южноамериканского опоссума ( Monodelphis domestica) ( Миккельсен и соавт. 2007 ), получив 31 473 851 б.п. из набора 185 575 непересекающихся экзонов. Использование кодирующих белок областей, а не всей доступной последовательности генома, является преимуществом, поскольку кодирующие области имеют меньше вставок и делеций и их легче надежно выравнивать на больших эволюционных расстояниях (~ 138 миллионов лет [Myr], т.е. 69 млн. Лет в каждой линии) ( Нильссон и соавт. 2004 ). Мы взяли первые 100 bp из 140 490 чтений тилацина, по крайней мере, 100 bp, сгенерировали 888 157 неперекрывающихся интервалов по 100 bp из наших numbat-чтений и сгенерировали 1 000 000 непересекающихся фрагментов по 100 bp из тамарского валлаби ( Macropus eugenii ) в архиве трассировки NCBI. Эти наборы последовательностей по 100 п.н. были выровнены с областями, кодирующими опоссум, в идентичных условиях. Фракция считываний из сохраненного в этаноле тилацина 2, которая выровнена по кодирующим областям (0,40%), составляла примерно одну треть от доли для нумбата и валлаби. Предполагая, что данные о numbat и wallaby полностью состоят из эндогенной ДНК, мы оцениваем, что 25-40% этого образца состоит из ядерной ДНК тилацина. Образец сухого тилацина имел несколько меньшую фракцию, которая соответствовала кодирующим областям, 0,27%.

Уровни повреждения ДНК (измеренные как дезаминирование цитозина к урацилу, приводящее к наблюдаемым поражениям, кодирующим цитозин → тимин), выше в образцах тилацина, чем в некоторых опубликованных образцах волос мамонта ( Гилберт и соавт. 2007a ). В сухом консервированном образце 0,51% остатков С в митохондриальном геноме живого животного были заменены Т; для образца, сохраненного в этаноле, этот показатель составлял 0,60%. Для сравнения: у одного мамонтового генома шерстистого мамонта ( Миллер и соавт. 2008 ), показатель составил 0,14%. Это, скорее всего, объясняется либо более высоким тепловым возрастом ( Смит и соавт. 2003 ; Гилберт и соавт. 2007a ) образцов тилацина по сравнению с образцом мамонта, влияние процесса консервации / хранения (процесс дубления или длительного хранения в разбавленном этаноле) или их комбинации (см. Дополнительный материал). С другой стороны, степень повреждения меньше, чем у образца кости мамонта ( Гилберт и соавт. 2007b ), подтверждая полезность стержней волос в качестве отличного резервуара для древней ДНК.

Хотя наши данные о последовательностях из образца, сохраненного в этаноле, включают ~ 20 млн. П.н. из ядерного генома тилацина, мы не смогли амплифицировать ПЦР-последовательности ядер дольше, чем 150 п.н. из этого образца. Этот вывод согласуется с предыдущими наблюдениями о том, что образцы тилациновой ДНК более деградируют, чем образцы из некоторых других вымерших видов, и подчеркивает высокую чувствительность подхода секвенирования следующего поколения.

Филогения тилацина

Предыдущие анализы с использованием cytb , 12S рРНК и ядерного гена для протамина P1 подтвердили родственные отношения Thylacinidae и Dasyuridae с базальными Myrmecobiidae (numbat) в пределах порядка Dasyuromorphia ( Краевский и соавт. 1997 , 2000 ). Тем не менее, эти ранние исследования были основаны на небольших матрицах (<2,9 кб) и не смогли определить положение тилацина с надежной статистической поддержкой.

Иерархические отношения между членами Dasyuromorphia были разрешены путем реконструкции филогении Marsupialia с максимальным правдоподобием и байесовских алгоритмов с использованием матрицы митохондриального генома размером 14,1 кб, включающей 24 разнообразных сумчатых таксона (). Анализ с использованием схемы кодирования с уменьшенным смещением (RB) Филлипс и соавт. (2006) включение всех сайтов в белки-кодирующие гены + гены РНК (с байесовской смешанной моделью и без нее), обнаружило сильную поддержку включения Thylacinidae в и, занимая базальную позицию, Dasyuromorphia (поддержка 100% начальной загрузки [BS], 1,0 апостериорная вероятность [PP]), с Myrmecobiidae в качестве сестринской клады для Dasyuridae (87% -95% BS, 0,99 PP). Предыдущие исследования только ядерных, RB-митохондриальных и комбинированных ядерно-мтДНК-данных показали связь между Dasyuromorphia и Peramelemorphia ( Amrine-Madsen et al. 2003 ; Филлипс и соавт. 2006 ), хотя и со слабой поддержкой начальной загрузки. Наши анализы вместо этого предпочитают Dasyuromorphia с Diprotodontia (). Однако, когда мы ограничили нашу матрицу теми же таксонами, отобранными Филлипс и соавт. (2006) а также Amrine-Madsen et al. (2003) мы также обнаружили их кладу Dasyuromorphia + Peramelemorphia, предполагая, что разрешение австралазийской сумчатой ​​филогении чувствительно к отбору таксонов.

( A ) Филогения сумчатых с максимальной вероятностью, основанная на митохондриальной матрице ДНК с уменьшенным смещением, которая помещает Thylacinidae в Dasyuromorphia. Дидельфиморфия была использована в качестве внешней группы, основываясь на результатах опубликованных ядерных и митохондриальных исследований ( Amrine-Madsen et al. 2003 ; Нильссон и соавт. 2004 ; Филлипс и соавт. 2006 ). Значения поддержки начальной загрузки, сопровождаемые байесовскими апостериорными вероятностями (BPP), показаны над соответствующими узлами. Первое значение начальной загрузки получено из матрицы с уменьшенным смещением, используемой для генерации дерева, а второе значение начальной загрузки основано на неизмененной последовательности кодирующих митохондриальных генов. Первое и второе значения BPP соответствуют RY-кодированному и не-RY-кодированному (смешанная модель) анализам. Узлы со значениями начальной загрузки 100% и апостериорной вероятностью 1,0 отмечены звездочками. Длина ветвей оценивалась по модели обратимых + гамма + инвариантов общего порядка эволюции последовательности. (ns) Не значимо, с поддержкой начальной загрузки ниже 50. ( B, C ) Филогения максимального правдоподобия, полученная из ( B ) 12S рРНК и ( C ) cytb последовательностей. Обратите внимание на большое расхождение между последовательностями из этого исследования (помечены как ThylacinusNew) и ранее опубликованными (ThylacinusKre) ( Краевский и соавт. 1997 , 2000 ).

Сравнение с опубликованными последовательностями

GenBank содержит две предполагаемые последовательности из митохондриального генома тилацина, последовательность 950 п.н. гена 12S рРНК (присоединение к GenBank {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "U87405", "term_id": "7144545", "term_text": "U87405"}} U87405 ) и последовательность гена cytb длиной 1146 п.н. {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "M99452", "term_id": "1778696", "term_text": "M99452"}} M99452 ) ( Краевский и соавт. 1997 , 2000 ). Эти последовательности отличаются от соответствующих частей наших двух сборок (которые идентичны по этим генам) на 11,2% и 15,6% соответственно на уровне нуклеотидов, хотя они группируются вместе с нашими последовательностями в филогении на основе каждого гена (). Наши попытки произвести многократный охват митохондриального генома из женского образца, который был изучен в Краевский и соавт. (1997) не удалось. Однако, когда мы сравнили трансляции аминокислот cytb из опубликованной последовательности Краевского с нашей сборкой прямого потомка образца Краевского (индивидуальный USNM 125345), который в теории должен быть эквивалентным, мы обнаружили, что они различаются в 33 положениях (т.е. они только на 91% идентичны). Мы проанализировали различия между двумя последовательностями в некоторых деталях (см. Дополнительный материал); Наше лучшее предположение состоит в том, что предыдущая последовательность представляет собой так называемую «numt» (митохондриальную последовательность с ядерной вставкой) ( Song et al. 2008 ), т. е. копия митохондриальной ДНК, расположенная в ядерном геноме. Кроме того, мы проверили все нуклеотиды наших сборок cytb, используя амплификацию ПЦР и секвенирование Сэнгера. Интересно, что более ранняя публикация ( Томас и соавт. 1989 ) сообщили о фрагменте 12S размером 103 п.н. и фрагменте cytb размером 116 п.н., которые соответствуют нашей сборке; они отличаются от записей GenBank по семи позициям, но согласны с нашими по всем, кроме одной позиции. Более того, как мы уже говорили в другом месте ( Гилберт и соавт. 2007a ), по существу, невозможно, чтобы используемый здесь метод секвенирования производил данные из numt.

метагеномика

Все считывания из двух образцов тилацина сравнивались с базой данных нередуцируемых белков NCBI с использованием BLASTX (транслированное сравнение ДНК с белком). Сравнительный профиль метагеномных видов, определенный с помощью версии beta2.15 программного обеспечения MEGAN ( Huson et al. 2007 ), изображен в. В общей сложности 15 625 операций чтения (23%) и 223 661 операции чтения (22%) могут быть отнесены к таксонам для образцов 1 и 2 соответственно. Поскольку метагеном образца 2 был секвенирован на глубину в 10 раз большую, чем образец 1, большая часть нашего обсуждения будет поэтому относиться к образцу 2. Большинство назначенных прочтений имеют бактериальное происхождение (154 670), с небольшой долей архейные (401) и вирусные (375) источники. Поскольку образец был плохо сохранен посмертно Лондонским зоопарком, его останки, по-видимому, подверглись внутренней гниению. Это видно по значительному количеству ДНК, обнаруженному у Enterococcus faecalis и других бактерий, связанных с посмертной деградацией.

Сравнительное метагеномное исследование двух биомов, обнаруженных в волосах образцов тилацина 1 и 2.

Интересно, что четыре из десяти наиболее распространенных видов бактерий, обнаруженных в волосах образца тилацина 2, представляют собой морские микроорганизмы ( Psychrobacter sp. PRwf-1qq, Psychrobacter cryohalolentis , Oceanobacillus iheyensis , морская актинобактерия PHSC201C1; см. Дополнительную таблицу в разделе S5); обнаруженные в нечувствительных волосах (см. рис. S5A, B). Кроме того, другими членами биома волоса являются микроорганизмы, такие как Shewanella frigidimarina , Shewanella baltica , Marinobacteria sp. Или Psychrobacter arcticus (дополнительная рис. S4B), которые также происходят из морской среды.

Сравнение метагеномов волос двух тилацинов показывает разительные различия в наиболее распространенных таксонах (дополнительная таблица S5). Большая часть морской биоты отсутствует в экземпляре 1, за исключением Polaromonas sp. JS666. Этот человек родился за пределами своей родной Тасмании во время переезда в Соединенные Штаты. Таким образом, он мог приобретать микробные сообщества вначале только в результате контакта между матерью и ребенком или, позже, в результате кормления и обитания в зоопарке. Его таксоны в основном связаны с почвенными организмами, такими как Rhizobiaceae и хищные δ-протеобактерии ( Bdellovibrio sp.) (Дополнительная рис. S4A). Альтернативно, различия в биомах волос могут быть объяснены с помощью различных методов консервации, применяемых к образцам. В то время как образец 2, скорее всего, был помещен в этанол в целом, что вызвало процессы внутреннего разложения, образец 1 был обработан профессиональным таксидермистом в USNM. Степень, до которой процесс таксидермии добавляется в биом волосяного покрова тилацина, неясен, хотя многие таксоны, наблюдаемые с высокой частотой, отсутствуют в туше, хранящейся в этаноле. Это Acidovorax sp., Pseudomonas sp ., Sphingomonas sp ., Burkolderia sp. И Flavobacteria sp. Одним из наиболее распространенных видов микробов, наблюдаемых с одинаково высокими показателями в обоих наборах данных, является аэротолерантная, анаэробная грамположительная бактерия Propionibacterium acne s ( Брюггеманн и соавт. 2004 ), комменсал, который, как известно, разлагает компоненты кожи, а также был зарегистрирован в желудочно-кишечном тракте нескольких видов млекопитающих.

Трехстороннее сравнение биомов тилациновых волос (образец 2), онеменных волос и онембровой печени также выявляет вирусные нагрузки (дополнительный рис. S6). Значительное число считываний с высокой степенью сходства с известными вирусами было обнаружено в образце волос с тилацином (дополнительное изображение S6A), в отличие от ни одного в волосах онемения (дополнительное изображение S6B); образец numbat обнаружил попадания только в бактериофаги, которые, вероятно, являются неотъемлемой частью зарегистрированных бактериальных организмов окружающей среды. Небольшое количество вирусных поражений было зарегистрировано для образца печени numbat (Supplemental Fig. S6C), который в противном случае не имел микробных следов. Однако некоторые из этих идентификаций таксонов могут быть результатом некодирующих последовательностей генома тилацина и человека, поскольку известно, что геномы млекопитающих содержат большое количество эволюционно старых эндовирусов. Даже если учесть эту возможность, очень высокая вирусная нагрузка, обнаруженная только в образце волос с тилацином, вероятно, возникла из жидкостей организма, которые были выпущены из туши в консервационную жидкость и проникли в материал волос во время хранения в водном этаноле. смесь. Поэтому неожиданное большое присутствие вирусной ДНК на внешней стороне животного может все еще указывать на плохое состояние здоровья во время смерти этого человека в Лондонском зоопарке в 1893 году.

Перспективы полного генома тилацина

Тилацин представляет собой гораздо большую проблему для молекулярной характеристики, чем многие другие виды, которые вымерли в течение последних 10 000 лет. Несмотря на усилия многих групп, только три короткие последовательности были ранее депонированы в GenBank (12S, cytb и ген протамина P1 ) ( Краевский и соавт. 1997 , 2000 ). Даже генерация этих двух митохондриальных последовательностей оказалась сложной и подверженной ошибкам (> 10%). Таким образом, становится приятным сюрпризом то, что наше исследование не только смогло секвенировать почти весь митохондриальный геном (за исключением высокоповторных гипервариабельных областей) с высокой избыточностью, но и 300 000 ядерных геномов считывают из этанолового образца 2 ( 20 Мб) и 20 000 ядерных считываний из образца 1.

Это предвещает возможность реализации полного ядерного генома тилацина с использованием метода секвенирования волос / следующего поколения. В то время как черновой вариант ядерного генома шерстистого мамонта ( Mammuthus primigenis ) был недавно создан ( Миллер и соавт. 2008 ), большая часть успеха этого проекта была связана с тем фактом, что у гигантских особей, как правило, была история холодного хранения. Напротив, тепловой возраст ( Смит и соавт. 2003 ; Гилберт и соавт. 2007a ) всех образцов тилацина высока, так как сто лет назад не было предпринято никаких усилий по сохранению тканей, отличных от дубленных или хранящихся в этаноле. Однако наблюдаемая средняя длина чтения для образца 1, равная 87,5 бит / с, при значительном числе операций чтения при максимальной длине чтения текущих инструментов Roche FLX (~ 250 бит / с), позволяет предположить, что в 50 одиночный забег. Предполагая, что размер генома схож с размером Monodelphis domestica (3,6 Гб), стоимость реагента менее 1 000 000 долларов США позволит создать набор данных сверх одноразового покрытия с использованием технологии секвенирования, использованной для этого исследования. Учитывая интерес к видам и прогнозируемое снижение затрат на секвенирование следующего поколения, цель полного генома тилацина кажется достижимой.

Выводы

Это исследование подтверждает использование древней ДНК, извлеченной из волос в сочетании с секвенированием дробовика с целым геномом даже для образцов с умеренной историей хранения и для случаев, когда нет данных о последовательности от близко родственных видов. Избыточное покрытие последовательности обеспечивает сборку с высокой точностью, избегая при этом артефактов, основанных на ПЦР, которые могут включать присутствие ядерно-вставленных митохондриальных последовательностей (чисел) ( Гилберт и соавт. 2007a ; Song et al. 2008 ). Напротив, традиционный подход, основанный на ПЦР, в лучшем случае трудоемок и может полностью потерпеть неудачу, как и в случае с тилацином, особенно когда нет тесно связанных последовательностей. Наконец, наш метод производит полный митохондриальный геном, который поддерживает анализы, которые являются более надежными, чем те, которые возможны с короткими митохондриальными фрагментами. Наличие точной последовательности митохондрий тилацина должно способствовать дальнейшим исследованиям этого привлекательного вида, таким как анализ временных изменений в митохондриальном разнообразии, ведущих к исчезновению.

Данные о последовательности ядерного генома из музейных образцов позволят непосредственно наблюдать результаты эволюционных событий, а не исследования, ограниченные выводами, основанными исключительно на образцах из живых организмов. В частности, они позволят оценить генетические факторы, которые влияют или находятся под влиянием процесса вымирания, обеспечивая ценный инструмент для будущих усилий по сохранению с точки зрения оценки риска вымирания у существующих исчезающих видов.

Систематическое исследование необходимо для определения факторов, влияющих на полезность музейных образцов для молекулярного анализа. В нашем случае, провалился ли анализ одного образца Смитсоновского института, а другой оказался очень успешным (см. Дополнительный материал) из-за различий в воздействии света в течение длительного периода? Эксперименты с использованием сравнительно расходуемых музейных образцов с различной задокументированной историей консервации, хранения и т. Д. Необходимы для информирования музейного персонала о том, какие риски отбора проб с большей вероятностью окупятся, чем другие, а также о том, как лучше сохранить как существующие, так и вновь приобретенные образцы в будущем. молекулярный анализ. Одним из компонентов таких исследований будет определение того, какие ассоциации с микробными видами возникают в результате конкретных историй сохранения и / или хранения, а какие отражают микробиом живого животного. Эти исследования, вместе с инвентаризацией глобальных музейных фондов, создадут основу для скоординированного и надлежащего использования музейных образцов для углубления нашего понимания эволюции и процесса исчезновения.

методы

Особи

Образец 1 тилацина был взят из USNM 125345, взрослого мужчины с таксидермическим статусом, который умер в Национальном зоопарке США в 1905 году. Образец 2 тилацина был из NRM 566599 в коллекции млекопитающих Шведского музея естественной истории (Стокгольм), взрослой самки, которая умерла в лондонском зоопарке в 1893 году и хранился в растворе этанола. Образцы волос и печени представлены на одном и том же человеке, DEC Donnelly District, номер M108, убитым автомобилем в Национальном парке Большого Кингстона, Западная Австралия. Пол животного не был записан. Дополнительный материал содержит дополнительную информацию об образцах.

Пробоподготовка и секвенирование

Подготовка библиотеки для образцов волос с тилацином и онембатом выполнялась, как описано ранее для шерстистого мамонта ( Гилберт и соавт. 2007a , 2008 ), и все размеры фрагментов были сохранены. Для образца печени numbat была проведена гелевая экстракция фрагментов с последующей подготовкой библиотеки, как описано ранее ( Миллер и соавт. 2008 ). Результаты этих более ранних работ, вместе с данными, представленными здесь для двух образцов numbat (), показывают, что по нашим протоколам к образцу не добавляется человеческое загрязнение.

Сборка последовательностей митохондрий тилацина и нумбата

Последовательность читает выравнивание митохондриального генома северного кволла ( Dasyurus hallucatus ; GenBank Accession {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "AY795973.1", "term_id": "55416188", "term_text": "AY795973.1"}} AY795973.1 ) были отфильтрованы и обрезаны так, чтобы требовалось не менее 70% выравнивающего покрытия и 60% идентичности, затем были собраны. Впоследствии все чтения были выровнены с собранными контигами с более высокой строгостью (охват 80% и идентичность 95%), и попадания были повторно собраны. Митохондриальные геномы тилацина имеют регистрационные номера GenBank {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "FJ515780", "term_id": "218135474", "term_text": "FJ515780"}} FJ515780 а также {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "FJ515781", "term_id": "218135488", "term_text": "FJ515781"}} FJ515781 в то время как митохондриальный геном numbat {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "FJ515782", "term_id": "218135502", "term_text": "FJ515782"}} FJ515782 ,

Филогенетический анализ митохондриального генома

Мы составили ДНК-выравнивание 24 сумчатых митохондриальных геномов. Они включали митохондриальные геномы, полученные в ходе этого исследования (образец тилацина 2 и нумбат) и геномы, загруженные из GenBank. Контрольная область была исключена из-за неоднозначного выравнивания сумчатых. Все белково-кодирующие гены ( NADH6 был исключен после Филлипс и соавт. [2006] ), рибосомные гены РНК и гены тРНК были выровнены с использованием CLUSTALX ( Томпсон и соавт. 1997 ); затем выравнивания были визуально проверены и скорректированы, чтобы свести к минимуму количество инделей. Были идентифицированы неоднозначные области выравнивания, и сайты с 502 нт были исключены, что дало матрицу последовательности 10 785 п.н.

Композиционное смещение в митохондриальных геномах сумчатых приводит к потере филогенетического сигнала, вызывая ошибки в восстановлении дерева ( Филлипс и соавт. 2006 ). Поэтому мы использовали подход «уменьшенного смещения» Phillips et al. уменьшить источники композиционного смещения. Эта схема RY-кодирует мтРНК (как стебли, так и петли), а Y-кодирует первые позиции и исключает третьи позиции белков-кодирующих генов. Мы также использовали ту же модель эволюции последовательности (GTR + I + Γ4), что и Филлипс и соавт. (2006) , Набор данных без RY-кодирования также был подвергнут поиску ML. Для обоих поисков ML начальные параметры были оценены во время первоначальной реконструкции дерева ML с помощью полного эвристического поиска с использованием начального дерева соединения соседей (NJ) и обмена ветвями с разделением на деревья (TBR) в PAUP * ( Своффорд 2003 ). Параметры модели были затем повторно оценены из дерева ML, и новый поиск ML был выполнен с использованием новых параметров. Эти шаги повторяли до тех пор, пока параметры модели не стабилизировались, а затем эти параметры использовались для восстановления окончательной филогении ML, на которой была выполнена оценка начальной загрузки ML (100 эвристических повторов с TBR). Деревья также были реконструированы с использованием байесовского алгоритма, реализованного в версии 3.1.2 MrBayes ( Ronquist and Huelsenbeck 2003 ), используя подход смешанной модели как с RY-кодированием, так и без RY-кодирования (все сайты включены). Два независимых запуска были выполнены с четырьмя независимыми цепями, отобранными каждые тысячу поколений в течение 5 миллионов поколений. Первые 1 миллион поколений были выброшены как выгорание. Мы определили сходимость между двумя сериями, когда среднее стандартное отклонение расщепленных частот было менее 0,01.

Оценка доли ядерной ДНК тилацина

Мы извлекли предполагаемые интервалы кодирования белка из ядерной геномной последовательности южноамериканского опоссума ( Monodelphis domestica ), основываясь на сборке (monDom4) и аннотации гена Ensembl (датированной 2006-07-31), которую мы загрузили из браузера генома UCSC по адресу http://genome.ucsc.edu/ , Мы выровняли эти интервалы с наборами фрагментов по 100 п.н., взятых из начальных частей достаточно длинных чтений тилацина и нумбата, и из чтений Сэнгера таммарского валлаби ( Macropus eugenii ), загруженного с ftp://ftp.ncbi.nih.gov / паб / TraceDB / macropus_eugenii /.

Эти фрагменты были выровнены по областям кодирования опоссума с использованием программы BLASTZ ( Шварц и соавт. 2003 ), оценивая совпадения в +1 и несоответствия в –2, и штрафуя разрыв длины n на –4 - n . Фракции выравнивающих фрагментов по 100 п.н. составляли 0,27% для тилацина 1, 0,40% для тилацина 2, 1,24% для печени нумбата и 1,10% для валлаби, что мы суммируем, говоря, что примерно в три раза больше фрагментов выровнено для нумбата и валлаби, чем к лучшему из образцов тилацина. Оценка соотношения ядерных и митохондриальных чтений следовала легко; см. Дополнительный материал для деталей.

Похожие

Комментарии